本文使用线扫描相机和声光偏转器(AOD)，构建了一个高速共焦激光线扫描显微镜，无需任何机械移动部件，可以生成高达191帧/秒的共焦图像(512×512像素)。线扫描仪由AOD和柱面透镜组成，可以扫描样品上的线焦点。使用50x物镜，z(深度)，x(垂直于线焦点)和y(线焦点方向)方向的测量分辨率分别为3.3μm，0.7μm和0.9μm。该共焦显微镜可用于分析生物和化学相互作用期间的快速现象以及用于快速3D图像重建。

图 1

高速共焦线扫描显微镜(high-speed confocal line-scanning microscope，HSCLM)的原理图如图1(a)所示，光源使用HeNe激光器。用两个凸透镜将激光束扩展以填充物镜的孔径。使用偏振分束器(PBS)和四分之一波片(WP)来最大化探测器收集的激光功率。图1中虚线矩形的柱面透镜(CL1)和声光偏转器(AOD，Isomet，Inc.，LS55-V)用作线扫描器，最终将点源转换为线源。线扫描仪的详细光线轨迹如图1(b)和1(c)所示，圆形光束最初通过CL1变成与x轴平行的椭圆形光束，AOD沿角度箭头表示的方向执行扫描。与其他扫描仪相比，AOD具有三个优点：高稳定性，可变频率和高衍射效率：AOD的一级衍射效率约为80％，最大衍射角为2.75°。由AOD衍射的椭圆光束通过两个透镜转移到物镜(50×，NA=0.8)中。然后，物镜在两个轴向位置上形成两个垂直线焦点。因为我们的光学系统是变形的，这两个轴线位置通常隔开一小段距离。由于入射椭圆光束的主轴(在物镜之前)平行于x轴并且其长度接近透镜孔径，因此矢状平面(SP)中的聚焦光束平行于y轴。以这种方式，焦线的宽度(在x轴上)接近衍射极限光斑的尺寸。如果聚焦线光束在物镜之后被准直，则聚焦光束的长度可以给出为l=a×f₃×f_ab/（f_cl1×f₄）。其中a是经过透镜后圆形光束的半径。由于光束不是准直的，因此该公式仅给出近似值。两个凸透镜(L3和L4)用于将光束引导到物镜中并使光束保持静止在物镜上(见图1(b)和(c))。从矢状平面(SP)反射的光束在从PBS反射后再次变为圆形，然后进入检测臂。检测臂中的柱面透镜(CL2)将圆形光束改变为平行于z轴的椭圆形光束。另一个柱面透镜(CL3)使聚焦光束与SP中的光束共轭。通过调节柱面透镜(CL3)和狭缝(S)选择性地检测从SP反射的光。采用线CCD(ATMEL，Inc.，AVIVASM2)相机来获得共焦图像。由于L-CCD相机的线采集速率为98kHz/线，因此对于512×512像素，图像采集速度最高可达191帧/秒。读出信号被发送到个人计算机中的帧抓取器以形成2D图像。计算机控制的微致动器(分辨率=1μm)用于沿z轴在载物台上移动样品。我们可以使用相同帧速率的计算机监视器监视共焦图像，本文中的所有共聚焦图像都是以191帧/秒的帧速率拍摄的。由于AOD的扫描速度由模拟信号外部控制，因此较高帧速率的唯一限制是CCD相机读出时间。因此，当使用更快的CCD时，可以进一步提高帧速率。

图 2

图2显示了用HSCLM拍摄的空军目标(Edmund optics，36408)的图像。本文中的所有共聚焦图像都是以191帧/秒拍摄的原始图像，并且它们尚未被数字图像处理技术处理。通过获得图2中的边缘响应的线扩展函数来测量x方向和y方向上的横向分辨率，分别如图3(a)和3(b)所示。x方向上的线扩展函数的半峰全宽(FWHM)约为0.7μm，而y方向的约为0.9μm。如上所述，由于线扫描方法的固有限制，y方向上的分辨率略微比x方向上的分辨率差。这是因为样品上的聚焦线的方向与y轴平行，因此，y方向的分辨率与传统光学显微镜的分辨率大致相同。

图 3

通过测量当镜子在焦点矢状平面上移动时穿过狭缝的光的功率来测试我们系统的轴向响应，观察到通常的共焦信号，如图4所示，FWHM约为3.3μm。z的正值表示物镜和镜子之间的距离增加。

图 4

图5(a)给出了微米尺寸光刻物体通过常规光学显微拍摄的图像。我们发现该物体具有高度为3.33μm的台阶结构。当样品台在焦平面上移动时，图像变得模糊，如图5(b)和5(c)所示。

图 5(a)通过常规光学显微镜;(b)载物台沿z轴移动，传统的显微镜无法分辨深度;(c)当载物台沿z方向移动2μm时拍摄这些图像。

为了演示HSCLM系统的深度分辨能力，当载物台在深度z方向上移动1μm时使用HSCLM拍摄了相同对象。如图6(a)-6(c)所示，可以使用我们的系统解决对象的3D特征。(共焦图像包含类似于干扰伪像的噪声，这可能是由不适当的狭缝对准引起的，可以通过优化狭缝位置或通过数字图像处理来消除这些噪声)图6(d)显示了用商业软件捕获的重建3D图像。

图 6

来自< Simple high-speed confocal line-scanning microscope>