拉曼光谱是一种振动光谱方法，提供有关样品化学成分的有用信息。拉曼光谱显示了识别没有外源标记的细胞的潜力，由于拉曼光谱是无标记且无破坏性的，使用其识别的细胞保持完整，可用于随后的研究，如药物测试或培养。

本文研究描述了两种在微流体环境中捕获单个细胞并收集这些被捕获细胞的拉曼光谱的装置，使用其识别分离肿瘤细胞。

图1：光阱，微流体泵，光纤激光器和拉曼微光谱仪的集成装置示意图。

图1给出该装置的示意图：将单模光纤（HI 1060，Corning，USA）连接到1070nm单模光纤激光器（5W，IPG Photonics，USA）。激光控制板准确和同步的提供用于捕获强度的调整。细胞捕获由大变焦物镜（10-140倍放大倍数）、单色Firewire CCD摄像机（DMK 31 AF03）和手动显微镜台监测。通过Nemesis注射泵系统（Cetoni，Germany）以皮升/秒的范围精度控制微流。泵模块包含五个泵，可以单独操作。 使用peek管道连接器（ILS，Germany / Jasco，Japan）将注射泵与装置连接。开发基于LabView的软件程序来控制激光器和泵系统。使用ImageJ处理数字图像。

图2

图2：(a)固定在样品架上的方形毛细管和激光光纤的侧视图；(b)对于不同的光NA，方形毛细管中的捕获几何形状；(c)毛细管调节架装置。

为避免光学畸变，石英毛细管采用方形截面而不是圆形。毛细管的尺寸为330×330平方毫米，内径为50×50平方毫米。由于光纤彼此之间以及光纤与毛细管的对准对于细胞的稳定捕获很重要，因此开发了用于精确调节的支架（图2c）。支架由光纤引导块组成，光纤引导块带有凹槽以容纳捕获激光器的光纤。光纤垫固定光纤，另一个金属块固定毛细管并相对于捕获光纤调节毛细管，调节螺钉将毛细管调节块压在PDMS块上。支架的尺寸等于标准显微镜载玻片（1英寸×3英寸）的尺寸。石英毛细管装置安装在拉曼显微镜Holoprobe上，该显微镜(100x，NA = 0.9非浸没物镜)连接到用于激发的785nm单模二极管激光Xtra和用于检测的拉曼光谱仪RXN1上。

选择玻璃用于微流体芯片制造。微流体装置的尺寸为16×25平方毫米，具有九个流体端口和四个光纤端口。拉曼光谱和光阱的设计将三个操作单元整合到芯片设备中：用于稀释细胞悬浮液并将单个细胞加载到捕获结构上的流动聚焦单元；具有用于单细胞拉曼光谱的设备的光阱结构；以及用于两个出口之间的流动切换和细胞分选的Y开关。

图3

图3a示出了结合在新型拉曼芯片RC2中的功能。将细胞注入通道b，将培养基注入a和c用于提供流体动力学聚焦和单细胞分离。通道d和e用于细胞分选，将捕获光纤插入通道1和2中。通道3用于清洁1和2。在捕获位置实现流速修改腔（图3b），扩张降低了流速，因此较小的力来捕获流动介质中的细胞。在图3c中，示了高浓度细胞悬浮液聚焦成细胞流。准确调节流速使得能够将单个细胞从储库注入右通道进入左通道，如频闪系列图像所示（图3d）。通过流动切换将细胞分选到d或e。将微流体玻璃芯片装置安装在配备用于激发的514nm Ar离子激光器（Lasos Lasertechnik，德国）的拉曼显微系统（WITec Instruments，Germany，60x，NA = 1.0水浸物镜)。

图4

将三种不同的肿瘤细胞系（OCI-AML3，MFC-7和BT-20）和作为对照的来自人供体的白细胞和红细胞注入基于石英毛细管的光阱中。 以100mW的激发功率获得拉曼光谱。 功率足够高从而能够在不改变设置的情况下，通过光镊力捕获细胞，连续测量所有细胞。图4是在785nm，100mW，10s采集时间的石英毛细管装置中单捕获细胞的平均拉曼光谱。

表1

表1是在石英毛细管内测量的拉曼光谱的LDA分类模型的混淆矩阵，激发波长为785nm，100mW，采集时间为10s。 两步LDA算法的总体准确率92.2％

20个红细胞中有19个，72个白细胞中有70个，92个BT-20细胞中有87个，74个OCI-AML3细胞中有70个被正确分类，分别给出了95%、97.2%、94.5%和94.6%的条件精度。MCF-7细胞较低的准确率为60%（25个中有15个）。有趣的是，大部分错误分类的MCF-7谱被分配给其他乳腺癌细胞BT-20（10个错误分类中的8个）。正如预期的那样，乳腺癌细胞的拉曼光谱相比其他细胞的拉曼光谱彼此之间更相似。

  图5

使用拉曼显微镜在514nm激光激发下捕获并测量微流体芯片中与上文中除红细胞以外的相同细胞类型。与785nm相比，该激发波长引起玻璃基板的混淆背景信号较少。为了减少由于不同折射率引起的空气—玻璃界面处的光散射损失，显微镜物镜和微流体芯片之间的间隙用水填充，使用水浸物镜。 每个光谱的采集时间为10秒。图5显示了用芯片装置测量的细胞系的平均拉曼光谱。图4和5中的拉曼光谱之间的主要区别是靠近600, 800和1060cm^-1基底材料的宽带，相对于细胞带的强度较低。

表2

表2显示了LDA分类的相应混淆矩阵。80个OCI-AML3细胞中的77（96.3％），87个MCF-7细胞中的83个（95.4％），29个白细胞中的25个（86.2％）和78个BT-20细胞中的75个被正确分类。 与表1相比，MCF-7和BT-20的分类得到改善。由于红细胞的直径较小，因此不能在芯片环境中收集这些细胞的光谱。因为收集光谱的质量较高，两步LDA算法的总体准确度为94.9％，高于毛细管环境。

来自<Tumour cell identification by means of Raman spectroscopy in combination with optical traps and microfluidic environments>