对于如何将微小粒子稳定地束缚在一个微小的探测区域内的问题，可以通过形成光学陷阱的方法来解决。光镊是利用高度聚焦的激光光束与折射率高于周围介质的粒子的相互作用，通过光子动量传递给粒子时，粒子受到反作用力，会被吸引到激光焦点处(此处激光密度最高，光场梯度最大)当作用在粒子上的梯度力远大于重力以及布朗热运动产生的力时，粒子可以被稳定的束缚在激光焦点附近。光学捕获共聚焦拉曼光谱技术(OTRS)，可以对单个微米级粒子进行捕获并进行拉曼光谱分析。这项技术具有较高的空间分辨率，它不仅可以用来表征单个细胞，对于微米级聚合物颗粒或者囊泡也能进行分析。

图 1拉曼光镊系统光路示意图

图1为拉曼光镊系统光路示意图，785nm激光自半导体激光器准直发出，光斑直径10mm，之后经干涉滤光片将其中杂散波长的光过滤掉，再经透镜L1、反射镜M3和二色分光镜进入显微镜。显微镜内部有一片二色镜BS2可以实现波长大于780nm的光线全部反射进入tube lens。激发光经过tube lens后又变成平行光斑，直径与物镜的通过孔径相匹配，满足形成光镊的条件。捕获光将粒子俘获后同时能激发拉曼散射信号。散射信号沿原路导出显微镜之后透过二色镜BS1，再由透镜L2准直，经两片边带滤色片(edge filter)将散射光中激发波长的光过滤掉，之后经非球面透镜L3聚焦进入光谱仪狭缝，其宽度约为20μm。狭缝的位置和捕获粒子平面形成共辆，这样可以将其他平面的散射光过滤掉，同时还能阻止外界杂散光进入，进而提高拉曼信号的信噪比。

拉曼光镊系统光路中主要元件有：

光镊光源：激光器的性能对于拉曼光谱测量以及光镊参数的标定都很重要。要得到好的拉曼光谱数据，需要激光器拥有很高地功率稳定性以及单色性。要实现光镊的稳定俘获，需要较高的功率，单横模结构。要得到恒定的光镊力，对光束功率稳定性要求很高。因此选择美国Crystalaser公司的DL785-120-S半导体激光器。该激光器为单横模(基横模TEM00)，功率为120mW，功率非常稳定，其波动范围小于1%，光束质量因子M²~1.1，发散角~1mrad，指向稳定性<0.005mrad/°C，波谱线宽小于2mn。此外由于紫外光照射聚合物时会发生光化学反应而使分子结构发生变化，可见光波长激发光探测偶氮聚合物具有很强的荧光对探测造成不利影响，近红外激光波长可有效降低样品产生的荧光对拉曼信号干扰，波长更长的激光，其热效应又会显著增加，不利于样品稳定存在。综合考虑以上几个因素，选用近红波长为785nm的激光光源。

拉曼光谱仪：LS-785拉曼光谱仪，其内部构造如图2所示，样品散射的拉曼信号以一定的汇聚角度，通过滤波狭缝，然后发散进入光谱仪，被准直透镜组(口径率f/2.0)准直之后，到达反射光栅(1200gr/cm)表面，不同波长的拉曼散射信号被散射到不同方向，再由聚焦透镜组(口径率f/2.0)汇聚到液氮制冷的CCD祀面上，被记录下来。再由控制器的处理芯片，将光信号转化成数字信号，再由数据线传输到电脑上存储，以待进一步分析。

图 2

Edge filter：边带滤波片(LP01-780RU，2片)，0°入射角，透光区间为790.1-1008nm。它的作用是：过滤样品散射出的785nm的瑞利散射光，透射大于785nm的拉曼散射光信号，单片滤波效率高达0D6；

Interface filter：干涉滤波片(LL01-780-12.5)，它的作用是：透过785nm的激发光，过滤掉激光器发出的杂散波长的光。滤波效率：0D>5，609-772.2nm&787.8-1201.8nm；

BS1：分光镜1，45°入射，反射785nm激发光，透射大于785nm的拉曼信号。BS2：分光镜2，45°入射，反射785nm的激发光以及大于780nni的拉曼信号，透射可见光用于CCD成像；

Ml，M2，M3，M4：键银全反射镜，45°入射，作用：光路转折，可以反射所有波长的信号；

L1，L2，L3，L4，L5为光路耦合凸透镜。其中L1为阱位透镜，L4为显微镜内的tube lens(管镜)，f1=175mm，f2=180mm。LI，L4共焦。L2为拉曼信号准直透镜，因为拉曼信号收集光路光程长，另外经过管镜的拉曼光为发散光，需要准直才能达到所需的光斑尺寸。L3为收集拉曼信号的非球面透镜，将拉曼信号聚焦到狭缝进入光谱仪，f3=30mm。L3的F数为2.0，与光谱仪LS-785内部透镜组的f数相匹配。

显微镜及CCD相机：倒置生物荧光显微镜(1X70，Olympus，Japan)，显微物镜为100倍的油浸物镜(100X，oil)，样品的成像使用的是美国Coolsnap公司的CCD(Coolsnap CF mono camera，USA)。样品的精细位移操作是由压电平台来实现的。压电位移平台使用的德国Physik Instrumente公司的P517.3CL，此平台由计算机控制，水平方向(X、Y方向)上的运动精度为1nm，在纵向(Z方向)上的运动精度为0.1nm。

测量步骤：1打开激光器；2打开显微镜的照明电源，将照明光调到合适亮度，打开CCD电源，打开CCD软件，监控样品成像；3打开压电平台电源，打开压电平台软件(PI2.1)面板，在三个坐标选框前打钩锁定样品位置，A，B方向调到50，C方向调到10；4组装样品池，配置实验样品，物镜滴油，样品池放到载物台上，显微物镜调焦使样品成像清晰；5通过压电平台移动样品池，使粒子靠近光讲中心，直到被光讲捕获；6打开拉曼光谱仪软件界面，等待CCD的温度下降到-120°C时，关闭显微镜照明光以及房间灯光采集光谱；7根据样品的拉曼光谱强度设置采样时间，如果需要观察动态过程，可以使用连续采集模式。

图3介绍了双阱拉曼光镊系统，将双光束光镊与拉曼光谱相结合，进行两个直接接触或间隔几微米的细胞的捕获，使用成像光谱仪将它们的拉曼散射光分离到CCD相机上。

图 3双陷阱拉曼光镊系统实验装置图

二极管激光束（λ=785nm）被50/50的分束器（BS1）分成两束，其中50/50的分束器与另一个分束器（BS2）重新组合，但在垂直（y）方向上具有小的角度间隔，使用M2和分束器（BS2）可以将两个陷阱的距离调整在1到10μm之间。使用二向色镜（DM2）将双激光束引入倒置显微镜的物镜（100x，数值孔径NA=1.30）以形成双光束光阱，在双阱中捕获两个聚苯乙烯小球（2μm直径），并且可以通过摄像机观察被捕获颗粒的图像。收集来自两个被捕获颗粒的向后拉曼散射并且聚焦到具有透镜L3（f=5cm）的成像光谱仪的入口狭缝的不同位置。然后对两个球体的拉曼图像斑点进行成像并由液氮冷却CCD（Roper Scientific Inc，SPEC-10：100BR）检测。成像光谱仪将拉曼光谱水平分散到CCD相机上，并将两个拉曼成像点聚焦到CCD相机的不同垂直行。CCD相机（1340×100像素，像素大小为20×20μm）可以编程为在图像模式或光谱模式下操作。当在光谱模式下操作时，垂直像素可以用选定的像素列（以获得两个单独的光谱）或未组合（以获得100个光谱）进行分级。在两个光阱中收集背景光谱，从两个捕获的粒子的拉曼光谱中减去背景光谱。

图 4

图4（a）显示了由双阱（相距约6μm）捕获的两个聚苯乙烯粒子的拉曼光谱图像，由在图像模式下操作的CCD相机记录。最亮的斑点对应于聚苯乙烯球体1001cm^-1处的拉曼带。图4（b）显示了在未组合光谱模式下操作CCD相机时两个粒子的三维拉曼光谱。这些图的结果表明双陷阱拉曼镊子是在共焦配置下操作的；将显微镜下一位置处的粒子的光谱成像到具有特定列的CCD相机的行像素上。只要将它们的垂直间距调整为大于每个聚焦光束的光斑尺寸（1-2μm），两个陷阱之间就没有交叉影响。图4（c）示出两个峰出现在列像素上，对应于两个被捕获粒子。用高斯拟合测量每个峰的带宽为2.5像素，对应于显微镜下的1.5μm的空间点。该斑点大小由每个陷阱的焦点大小决定，略小于粒子尺寸。

图 5

应用双阱拉曼光镊监测培养基中芽殖酵母细胞的动态生长，如图5的插图所示。随机选择由母细胞和子细胞组成的出芽酵母，使得母细胞被一束光捕获，子细胞被另一束光捕获。图5的插图显示保持在双阱中的子细胞仍在生长，并且细胞大小在40分钟期间略微增加。图5（a）和5（b）显示了将它们转移到新培养基后不同时间的子细胞和母细胞的拉曼光谱。

图5（a）和5（b）中的光谱数据显示（1）子细胞和母细胞之间的光谱明显不同，表明它们具有不同的分子组成，（2）子细胞和母细胞的分子组成在萌芽过程中发生了变化。例如，两个细胞中1445cm^-1处的脂质和蛋白质CH带增加，表明培养时细胞生长。（3）子细胞的细胞核带（1093，812和783cm^-1）显着增加，而母细胞的这些条带的变化相对较小，表明子细胞的生长快得多。这也可以从子细胞的明显尺寸增加来验证（参见图5中的插入延时图像）。我们能够使用一对快速扫描的Galvano反射镜（参见图1）在出芽细胞的大部分区域扫描双光束，而不会在光谱采集过程中移动细胞，从而可能在激光束减少的情况下形成小的内部细胞器的积聚。可以通过镜子M2或BS2调整双陷阱的垂直间距。

应用双阱拉曼光镊监测距离接近3μm的两个Bt孢子的动态萌发过程中对L-丙氨酸营养的响应，如图6所示。

图 6

图6（a）和（b）为加入10mmL-丙氨酸后在双陷阱中捕获的两个单独Bt孢子的延时拉曼光谱；（c）为两个Bt孢子的824，1017和1572cm^-1处CaDPA带的相对强度随培育时间的变化；结果表明：（1）当孢子从核中释放出CADPA时，与CADPA相关的所有拉曼带（如1017，824和1572cm^-1）同时降低；（2）孢子1在暴露于L-丙氨酸时完成CADPA释放所需的时间与孢子2显著不同，表明孢子萌发的细胞异质性显著。（d）为1450和1655cm-1条带的拉曼强度与培养时间的关系

来自<Dual trap Raman tweezers for probing dynamics and heterogeneity of interacting microbial cells>

《拉曼光镊表征偶氮聚合物囊泡光响应机理研究》