本文介绍一种单分子实验系统，在该系统上可以实现共焦扫描显微镜、荧光偏振探测和宽场照明荧光显微镜等功能。

该系统使用一台倒置荧光显微镜（NikonTE2000-U）作为主体，如图1所示。皮秒脉冲二极管激光器（PicoQuant,PDL808）和He-Ne激光器分别作为脉冲和连续激发光源，皮秒脉冲二极管激光器输出波长为630~640nm可调、脉冲半高全宽70ps、内触发频率可达40MHz的超短激光脉冲。激光首先通过一偏振分光棱镜得到线偏光，然后再通过一个λ/4波片将线偏光转换为圆偏光（由于样品中的单染料分子的取向随机分布于玻片上，圆偏光可实现对所有分子的有效激发），最后激光经耦合器耦合进入单模保偏光纤。实验中光纤的两个主要作用：1、可以对激光光斑整形；2、根据实验要求需要调整激发光时，光纤后端的光路不需要进行调节。

在单分子实验系统中，扩束镜非常关键，滤光片只能对扩束后的激光进行有效过滤，光纤输出的激光由扩束镜将光束扩束5倍左右，从倒置共焦显微镜的后端入射。激发光首先通过一个滤波片过滤其波长范围以外的光，然后由一个二向色镜反射进入显微物镜，物镜将激光聚焦至纳米位移台上的样品上，对染料分子进行激发。分子被激发后发射的荧光光子被同一个物镜收集后通过二向色镜、发射滤波器和陷波滤波器滤除分子荧光之外的杂散光，之后通过反射镜或分束棱镜进入EMCCD进行宽场成像。或通过一个焦距20cm的Tube透镜聚焦到一个高能针孔进行空间滤波，将来自物方焦平面非共焦位置的信号和杂散光过滤掉，只有处在共焦区域内的分子发出的荧光可通过针孔。通过针孔的光束经过焦距为5cm透镜转换为平行光，然后通过50/50的偏振分束棱镜进行分光，最终分别进入两个单光子探测器进行计数，探测器输出的信号输入NI数据采集卡进行光子计数分析。

图1

通过增加透镜和偏振分束棱镜，共焦扫描显微系统可以改造成为宽场照明的荧光显微镜和荧光偏振探测系统。在针孔后端增加一个偏振分束棱镜就可对荧光信号进行偏振探测，可用于跟踪测量单分子偶极取向的变化。在激发光路中增加一焦距为500mm的透镜，在显微物镜上方形成宽场照明并使用EMCCD进行成像，就转化为一个宽场照明荧光显微镜，可以用于单分子跟踪和成像。

实验装置如图2所示，短脉冲激光器（PicoQuant,PDL808），输出重复频率为40MHz的脉冲激光。函数信号发生器(Agilent,33250A)输出频率，峰值为4V的正弦波调制信号加载在声光调制器(Crystal Technology,3080-122)的驱动模块上，对脉冲激光进行强度调制。经过正弦波调制后的激光通过一个偏振分光棱镜和一个λ/4波片将线偏光转变为圆偏光，随后耦合进入到一根单模光纤中进行光斑的整形，由光纤出射的光束通过一个扩束镜进行扩束后从倒置共焦显微镜的后端口进入显微镜。激光首先通过一个激发滤波片过滤去激发以外区域波长的光，然后通过一个二向色镜反射进入显微镜物镜（100×，油浸），物镜将激光聚焦到置于纳米位移台的样品上对染料单分子进行激发。

分子被激发后发射的荧光光子被同样的物镜收集后通过二向色镜、发射滤波器和陷波滤波器滤去除分子荧光之外的杂散光，通过一个焦距为20cm的Tube透镜聚焦到一个高能针孔上进行空间滤波，将来自物方焦平面非共焦位置的信号和杂散光滤掉，只有处于共焦区域的分子发出的荧光可以通过针孔。通过针孔的光束经过一个焦距为5cm透镜转变为平行光后进入一个单光子探测器进行计数，由探测器输出的信号进入数据采集卡上进行光子计数和分析。将单光子探测器输出的TTL电脉冲信号进入到锁相放大器(MFLI)中，锁放积分时间为30ms。函数信号发生器的同步信号输入锁相放大器作为参考输入信号，对探测到的信号进行解调，只使包含荧光信号的调制波得到放大，抑制了其他频率的背景信号。通过NI 6251数据采集卡及LabVIEW程序控制三维纳米平移台对分子进行扫描同时对单光子输出电脉冲进行计数和采集锁相放大器输出的模拟信号。

图2

采用频率为30kHz正弦波信号作为激光调制信号，对激光进行强度调制。记录单光子探测器输出的光子计数的信号如图3(a)所示，图中显示的连续的方波控制分子激发光的通断形成的，主要是为了观测荧光发射的起伏度。图3(b)是同时采集的由锁放解调后的分子荧光信号。从图中3(a)可以看到单分子荧光的平均光子计数N约9k，光子计数的起伏ΔN大约3k，那么可以得到荧光信号的起伏ΔN/N=1/3；从图3(b)中可以看到单分子荧光解调后的平均信号V大约3.6mV，信号起伏ΔV大约0.3mV，那么荧光信号起伏为ΔV/V=1/15。可以看出，经过调制解调后分子荧光的起伏由1/3减小为1/15，荧光起伏大幅度地减小。那么这种小涨落的荧光信号用于将会获得高对比度和高平滑度的单分子荧光成像。

图3

函数信号发生器输出的正弦波调制信号加载到声光调制器的驱动模块上，对皮秒脉冲激光器输出的激光进行正弦波强度调制，被调制后的激光通过二向色镜反射后进入显微镜物镜聚焦并照射分子样品，分子样品置于三维纳米平移台上，计算机控制三维纳米平移台进行扫描，显微镜物镜收集分子发出的荧光，显微镜物镜的空间分辨率约为0.3μm，单光子探测器收集入射的荧光单光子信号（大约为10kHz）。一方面单光子信号直接由LabVIEW程序进行光子计数成像，单分子光子计数成像结果显示在图3(a)中。另一方面由单光子计数器输出的光子计数信号输入到锁相放大器中，函数信号发生器输出的同步信号作为锁相放大器的参考信号，锁相放大器对光子计数信号进行解调后输出的模拟信号由LabVIEW程序进行模拟成像，单分子模拟成像结果如图3(b)所示。

在图4的成像过程中，选择100nm的扫描步长，扫描像素为100 pixels×100 pixels ，在样品玻片上的x-y平面的扫描区域为10μm×10μm，成像所用时间大约为200s。图4(a)和图4(b)的成像位置为相同样品的同一扫描区域。图中白色的亮斑为单分子发射的突光其代表着一个SR单分子，黑色为基底背景。通过对两图进行比较，可以发现单分子荧光的光子计数成像所获得的单分子成像光斑其明亮起伏很大，甚至有些单分子的信号很弱。解调后的单分子荧光成像大多为明亮的成像光斑，并且发光均匀与基底背景的对比度很高，甚至一些荧光信号很弱的分子仍然有很大的信噪比。通过计算分析光子计数成像的信噪比大约为8，而经过锁相放大器解调后的单分子荧光成像的信噪比高达40，信噪比改善了5倍。信噪比的改善主要源于光子计数的调制解调技术可以很大程度改善分子荧光发射的起伏、有效地抑制背景信号，从而可以获得高清晰度的单分子荧光成像。

图4

在图5中，我们对比了一个单分子的荧光光子计数三维立体成像与调制解调后的模拟信号的三维立体成像，在该成像中我们将扫描步长减小到25nm，扫描像素为40 pixelsc×40 pixels，在x-y平面的扫描面积为1μm×1μm。单分子的荧光光子计数成像的三维立体图像和解调后的荧光成像的三维立体图像分别如图5(a)和图5(b)所示。从图5(a)中可以看到光子计数的荧光起伏较大，而采用通过解调后的荧光成像则非常平滑。

图5