目前，基于荧光吸收效率对激发光偏振方向的敏感性提出的偏振荧光显微技术，通过分析荧光辐射对激发光偏振方向的响应可以获取荧光分子的方向信息，成为研究生物分子方向及结构信息的有力工具。本文基于宽光场荧光显微系统，利用电光调制器（EOM）配合1/4波片对激发光偏振方向进行快速控制，配合相机曝光记录对应的偏振荧光图像，同时在数据采集和偏振控制方面采用硬件同步的方式减少测量过程中与计算机通信和数据交换的时间，以最大程度地提高测量速度。对激发光路产生的偏振畸变进行测量和补偿，确保偏振控制的准确性。利用巨型单层囊泡(GUVs)对系统进行测试验证，结果证明该系统能以近视频帧率对分子方向信息成像，具备监测动态样本的能力。

整个光路系统基于倒置荧光显微系统(IX51型,Olympus公司,日本)进行搭建，如图1(a)~(c)所示。

图1(a)高速偏振荧光显微系统示意图;(b)偏振图像采集信号控制时序;(c)偏振控制光路

半导体激光器(Calypso型,Cobolt公司,美国)发出波长为491nm的连续光波，将其作为激发光，激发光进入由半波片(WPH05M-488型,Thorlabs公司,美国)和格兰偏振器(GTH5-A型,Thorlabs公司,美国)组成的功率调制模块。在该模块中格兰偏振器的透射轴沿垂直方向固定，通过旋转半波片可以改变输出垂直线偏振光的功率，以适应样本和相机的曝光时间。垂直线偏振光经由EOM(PockelscellNo28-Np型,Quantumtechnology公司,美国)和1/4波片组成的偏振方向控制模块后变为具有不同偏振方向的线偏振光。扩束镜(BE05-10-A型,Thorlabs公司,美国)放大光斑的尺寸需匹配显微物镜后焦平面的入射孔径。线偏振光被二向色镜(FF499-Di01型,Semrock公司,美国)反射后进入显微物镜被聚焦，以照亮样本平面并激发样本。样本受激发后出射的辐射荧光经同一物镜返回，透过二向色镜和荧光滤光片后被相机(ORCA-Flash4.0LT,Hamamatsu公司,日本)曝光成像。

使用数模转换卡(NI-USB-6351型,NI公司,美国)生成模拟电压输出信号，通过电压放大器(2350型,Tegam公司,美国)的放大电压信号来控制EOM，以进行偏振控制。整个控制电路设备带宽均超过1MHZ，从而可确保偏振控制的响应时间小于1μs。在电压信号控制生成的具有特定偏振方向的线偏振光激发下，通过相机曝光记录相应的荧光图像。为了最大程度地提高偏振荧光图像序列的获取速度，在偏振控制和相机曝光过程中减少数模转换卡、相机与计算机通信的时间，利用数据采集卡的内部存储空间预设所需偏振方向的对应电压序列以及每个电压的维持时间。相机选用动态连拍模式，设其曝光周期与偏振方向所对应的电压信号维持时间一致，相机曝光图像数量与偏振方向调制个数相同。数模转换卡输出同步信号，触发相机开始曝光第1幅荧光图像，之后相机根据曝光时间和曝光图像数量自动曝光记录，并利用自身内部存储空间存储整个偏振荧光图像序列，最后一次性将图像输出到计算机。具体数据采集控制序列如图1(b)所示。

在系统中利用EOM配合QWP来实现入射激发光偏振方向的控制。所选EOM为基于泡克耳斯效应的泡克耳斯盒(No28-NP型,Quantumtechnology公司,美国)。泡克耳斯效应为线性电光效应，施加电场引起的快慢轴相位差与所施加电场呈线性关系，通过施加电场产生双折射效应。其中泡克耳斯盒的主轴与X轴成45°放置，QWP的快轴方向沿垂直方向（Y轴）固定，与入射的垂直线偏振光方向相同。出射光仍为线偏振光，其偏振方向的旋转角度为泡克耳斯盒快慢轴引入相位差的一半。荧光偏振显微系统中，需要激发光偏振方向从0°到180°旋转，因此需要泡克耳斯盒引入0°～360°的相位延迟，对应的电压信号为0～400V，偏压为-200V。为此，数模转换卡生成±2.5V的模拟电压信号，并通过电压放大器进行80倍电压放大，生成的-200～200V电压信号用来实现出射光从0°～180°的旋转。激发光偏振方向与模拟输出电压之间为线性关系（由于泡克耳斯效应为线性电光效应），任意所需偏振方向对应的控制电压可以通过线性差值计算得到。在偏振控制实现环节中，泡克耳斯盒具有非常高的线性度，而选用的数模转换卡具有输出16bit模拟电压的高分辨率，因此偏振方向的控制精度主要取决于电压放大器。本系统所选用电压放大器的失真度约为0.1%，而泡克耳斯盒的灵敏度为13mrad/V，因此在最大偏压200V(-200V)时会产生0.15°左右的偏差，该偏差可以忽略。

选用GUVs作为测试样本对系统进行实验测试。GUVs是通过电化学方法制备的人工球形空腔，表面覆盖单层磷脂分子膜，其磷脂分子均匀排列在球形表面，具有与细胞膜相似的磷脂分子排列结构，被广泛用作标准样本来模拟细胞膜的结构和功能。在制备过程中加入荧光分子并对磷脂分子进行标记，其刚性键合链接使得荧光分子排列方向与磷脂分子相关。样本制备中选用的磷脂分子为DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)，选用的染色荧光分子为di-8-ANEPPQ，磷脂分子与荧光分子的摩尔比为1000:1。这种荧光分子在键合作用后具有与磷脂分子相同的极性方向，垂直于球形表面均匀排列，如图2(a)所示，黑色圆圈内为激发光斑内荧光分子（红线）方向的统计描述（包括平均方向θ和方向偏差Ω）。图2(b)为激发光斑内荧光分子在激发光偏振方向α调制下的荧光响应曲线，α＝θ处为最大响应位置。实验中激发光的偏振角α从0°旋转至180°，间隔为10°，相机曝光记录偏振荧光图像序列，相机采用512pixel×512pixel的子阵列分辨率，可以达到400pixel/s的曝光速度，每幅图像用时2.5ms，因此整个偏振荧光图像序列的获取时间为47.5ms。图2(c)给出了在不同偏振角α下曝光记录的其中一个巨型囊泡样本赤道平面的荧光图像。可以看出在不同偏振方向的激发下，辐射光强分布在变化，对于同一位置，当激发光的偏振方向与该位置处荧光分子的平均方向一致时，其辐射荧光会达到最大值。

图2(a)巨型囊泡赤道面上磷脂分子排列示意图；(b)偏振角为α 时的荧光强度；(c)在不同偏振角激发光下CCD曝光记录的荧光图像

　图3(a)展示了偏振荧光图像序列叠加在一起的辐射荧光总强度。从获取的偏振荧光图像序列中对每个像素位置沿偏振方向α提取荧光响应曲线，图3(b)展示了图3(a)中4个不同位置(A、B、C和D)的荧光响应。偏振响应I(α)为频率为2α的余弦函数。据此设计拟合函数y=a·cos[2(α-b)]+c，对所获取的偏振响应进行以2α为频率的余弦拟合，其中拟合系数a反映响应曲线的R，b为光斑内荧光分子的平均方向θ，c为偏振响应的平均值。对上述获取的偏振荧光响应进行拟合后，可以看出偏振荧光响应符合预期的余弦分布。对获取的荧光图像序列进行数据处理，每个像素位置处荧光分子的平均方向θ为该位置处荧光响应曲线最大值对应的偏振方向α，处理结果如图3(c)所示。从图3(c)中可以看出，荧光分子的平均方向θ沿囊泡的轮廓线从0°变化至180°，符合预期，囊泡周围和内部荧光分子方向随机分布，因此其最大响应位置也是随机的。同时根据R的定义，满足

式中max()代表取最大值，min()代表取最小值，mean代表取平均值。对每个位置的调制响应进行处理，计算其偏振响应调制幅度R，计算结果如图3(d)所示。由图3(d)可以看出，在囊泡赤道面的分子膜轮廓上，R约为0.05，表面轮廓上所有位置的调制幅度保持一致，说明激发光斑内分子排列方向的偏差Ω保持一致，这与囊泡本身磷脂分子均匀排列分布的事实相符合，意味着高速偏振显微系统在获取各个位置荧光分子的方向信息时具有相同的效率。囊泡内外由于平均荧光信号小而没有偏振响应，所以其R值偏大且随机分布。

图3(a)各个偏振荧光图像叠加后总的荧光强度图像；(b)图3(a)中A、B、C、D4个位置处荧光调制响应以及拟合后的荧光调制曲线；(c)平均方向角θ；(d)调制幅度Ｒ

来自《基于电光调制器的高速偏振荧光显微系统》，光学学报