对于典型的双光子荧光显微成像系统，其产生双光子荧光的条件是荧光分子同时吸收两个激发光的光子，因此实际中通常使用飞秒级的脉冲激光器作为光源，既能够提供足够的入射光强度，又因为两个脉冲之间存在时间间隔，使光束的平均能密度不至于太高而产生大量热量损伤细胞。因此，双／多光子荧光显微成像系统具有以下优点：

多光子激受的激发光往往选择的是波长较长，光子能量较小的近红外光，相比于单光子成像用的紫外光、蓝光，对生物组织的伤害更小；能量较低的长波长光子不容易激发生物组织本身的荧光，从而大大降低了组织自发荧光造成的背景信号干扰；因为激发光波长较长，生物组织对入射光的散射作用也随之减小，能保证较大的成像深度；由于多光子激发条件的苛刻性，使得多光子显微镜的光毒性和光漂白仅发生在焦点周围的极小区域，适合对活细胞、活组织的长时间成像观察；多光子显微系统天然具有高聚焦性，可以不需要共聚焦针孔（共聚焦针孔的存在会阻挡大部分信号光），同时一般多光子显微系统的光程较短，信号光的损耗小，两者都提高了荧光信号收集效率，成像灵敏度化随之得到提高。

因此本文介绍了一种使用聚集诱导发光染料TTF分子作为荧光探针，对活细胞和活体小鼠脑部血管进行多光子荧光显微成像的实验方案。

实验仪器有：JEOL公司的JEM-1230型透射电子显微镜（TEM），Shimadzu公司的UVJ600紫外可见分光光度计，HITACHI公司的F-2500荧光分光光度计，Olympus公司的FV1000激光共聚焦显微镜，Idea optics公司的PG2000光纤光谱仪。TTF分子的制备及其非线性光学性质见文献1第三章。

对于液体及显微区域样品光谱的测量，一般使用如图1所示的非线性光学显微系统（简称光谱测量系统一）。系统具体搭建步骤如下：将波长为1560nm的飞秒激光器（FLCPA-01C,CalmarLaser,1MHz，400fs）的激光束耦合进激化共聚焦扫描显微成像系统（BX61+FV1000,Olympus）。光束被二向色镜DC1（1000-1600nm反射,400-950nm透射，Chroma Technology公司定制）反射，然后通过两个振镜进行逐行扫描。扫描光束通过一个扫描透镜和一个镜筒透镜，成像在显微物镜的后焦面上。用一个水镜（XLPLN25XWMP2,Olympus,25X，NA=1.05）聚焦光束于样品上并同时收集产生的三光子荧光或三倍频信号。水镜收集的信号（<900nm）穿过镜筒透镜、扫描透镜、两个振镜，二向色镜DC1和共聚焦系统的针孔（800μm），由光纤光谱仪（PG2000,IdeaopticsInstruments）收集记录。本套系统的主要优点在于结合了共聚焦成像系统，因此可以对需要进行光谱测量的区域进行显微成像，获得显微区域的光谱信息。

图1用于光谱测量的非线性光学显微系统示意图

对于固体样品其非线性光谱性质的测量，一般采用如图2所示的非线性光学检测系统（简称光谱测量系统二）。该套探测系统可结合多个激光光源系统，本处介绍两套飞秒激光光源，一套是由钛－蓝宝石飞秒激光（>4W,800nm,MiraHPCoherentInc.）泵浦的光参量振荡器（OPO,80MHz,脉宽:200fs,可调谐波长:1000nm到1600nm,Mira-OPOCoherentInc.）。另一套是由一个钛－蓝宝石振荡和放大系统（Mantis and Libm Coherent Inc.）系浦的光学滲量放大（TOPAS ,Coherent Inc.）生成的光学参量放大器（OPA,1KHz,脉宽<130fs,可调谐波长:1600nm到2600nm,TOPASCoherentInc.）。激光束通过一个长通滤光片和1/4波片，耦合进入物镜（10x,NA=0.25）用于获得激发样品的高强度激光。获得的非线性光学信号被另一个前置的物镜收集（10x,NA=0.25），通过一个短通滤光片之后由光纤光谱仪（PG2000,Idea optics Instruments）收集并记录。本系统主要用于测量固体样品的非线性光学性质，具体来说，将TTF样品溶于氯仿之后滴在载玻片上，等氯仿自然挥发之后，形成固体薄膜进行实验测量。

本套系统最大的优点是荧光收集物镜后面直接连接光谱仪的光纤进行信号收集，具有非常短的光程，因此，荧光信号的损失最小，可用于弱荧光信号的收集。同时，由于一般三倍频信号都具有前向性发射的特点，从侧面难以收集，而此套系统即为前向信号收集，因而可用该系统进行三倍频信号的收集。但其也存在缺点，因为很多激光光源中往往混杂一些短波长的杂散光，由于激光功率较强，这些杂散光通过滤光片难以完全滤出，因此也可能被光谱仪收集，从而对我们所需荧光信号的收集产生影响。

图2用于TTF固体样品非线性光学性质测量的系统示意图。

对于激发光源为1950nm-fs激光，放置于比色皿中的TTF有机溶液的非线性光学参数的测量，主要采用如图3所示的非线性光学检测系统（简称光谱测量系统三）。该测试系统主要结构如下：1950nm的飞秒激光光束通过一个长通滤化片和1/4波片，通过一个透镜聚焦在装有了TTF有机溶液（氯仿或甲苯）的比色皿边缘样品处，激发产生的荧光通过另一个物镜（10x,NA=0.25）在侧向收集，经过一个短通滤光片后由光谱仪记录数据。

图3溶于有机溶剂的TTF的四光子荧光光谱测量系统示意图。

光谱测量系统一、系统二和系统三均适用于材料的光谱测量，但各有适用的场景。系统一适合于毛细管内的液体样品和显微区域样品的光谱测量，同时，还可结合共聚焦的成像功能进行成像。系统二适合于玻片上的固体样品或者扁化色皿中的液体样品的光谱测量，且该系统光程较短，损失信号较少，具有更高的收集效率。系统三适合较大量液体样品的测量，同时光程短，收集效率相对较高，但因为收集物镜在样品的侧面，因此只能收集荧光信号，不能收集三倍频信号（一般需要前向收集）。

荧光寿命成像显微系统（Fluorescence Life time Imaging Microscope, FLIM）用于材料荧光寿命的测量，其示意图如图4所示，将激发光束（1040nm,50MHz,100fs），引入商用的激光共聚焦系统（BX61+FV1000,Olympus），激发样品后由一个光电倍增管（PMT,HPM-100-50,Becker＆Hickl GmbH）收集，同时结合一套时间相关单光子计数（Time Correlated Single-Photon Counting, TCSPC）系统（SIMPLE-TAU-150-DX,Becker＆Hickl GmbH），测得样品的双光子荧光寿命。

图4用于双光子荧光寿命测量的系统示意图

用1020nm-fs激光分别进行TTF-ORMOSIL纳米颗粒和无修饰的TTF分子的细胞双光子荧光成像，如图5所示，在相同的双光子荧光成像条件下，对于未经过修饰的TTF标记的HeLa细胞，几乎看不到其荧光信号，而对于TTF-ORMOSIL纳米颗粒标记的HeLa细胞，可观察到明显强烈的双光子荧光，且通过与透射成像视场的重叠，看到纳米颗粒基本都分散于细胞上，表明其的确对于细胞有标记作用。对于大多数细胞而言，其细胞膜是净带负电的；而表面修饰了氨基、并包覆了TTF分子的有机二氧化硅纳米颗粒，其表面净带正电。通过两者之间的静电作用纳米颗粒就能够轻易的标记癌症细胞。且纳米颗粒本身的平均粒径比较小（25nm），也有利于它们透过细胞膜进入细胞中。此外，因为TTF分子的AIE特性，在二氧化硅的包覆下，形成了纳米线的聚集体，这本身也有助于双光子荧光的增强。相应的，无修饰的TTF分子则因为其在细胞微环境中的不稳定性且无聚集情况的发生，并不能产生明显的荧光。

图5分别用TTF的DMSO溶液(A-C)和TTF-ORMOSIL水溶液(D-F)处理的HeLa细胞的双光子荧光成像图。其中（A,D）透射成像;（B,E）荧光成像；（C，F）透射和荧光成像通道的重叠。（激发：1020nm-fs激光，标记时间：2h）

之后在双光子荧光成像条件下探究了TTF-ORMOSIL纳米颗粒不同标记时间对细胞成像结果的影响。并同时用了一种商用发蓝色巧光的特异性标记细胞核的染料－DAPI，来观察TTF-ORMOSIL纳米颗粒在细胞核位置的分布情况。如图6所示，在标记30min后，TTF的双光子荧光并不明显，但随着标记时间的增长，到1h，己经可以看到较强荧光，2h后，TTF的双光子荧光已经能够明显标记出HeLa细胞的轮廓。此外，我们可以观察到DAPI发出的蓝色荧光和TTF的红色荧光存在重叠部分，这表明TTF-ORMOSIL对细胞核也有一定的标记能力。

图6TTF-ORMOSIL标记的HeLa细胞的双光子荧光成像、透射成像、DAPI标记的巧光成像，及三个通道的其重合图。（TTF激发:1020nm-fs激光，DAPI激发:405nm-CW激光）

为了探究TTF-ORMOSIL纳米颗粒能否进入细胞核，我们进一步用共聚焦显微镜的3D荧光成像重构对其进行了表征。如图7所示，在DAPI荧光通道和TTF荧光通道的重叠图中可见，除了HeLa细胞的细胞质部分，TTF的荧光信号也出现在细胞核部位。3D荧光成像重构图对其位置做了进一步的确认，如图7B，7C所示。这为将来用TTF-ORMOSIL作为载体运送一些生物分子/药物进入细胞核提供了选择。

图7同时标记TTF-ORMOSIL纳米颗粒和DAPI的HeLa细胞的单光子共聚焦荧光成像，（Ａ）两个巧光成像通道的重叠。TTF-ORMOSIL纳米颗粒在（Ｂ）细胞质和（Ｃ）细胞核部位的3D重构图。（TTF激发：520nm-cw激光，DAPI激发:405nm-cw激光）

文献1《聚集诱导发光染料的非线性光学性质研究及生物成像应用》