根据频率上转换的基本原理，以飞秒脉冲激光及相关的光学器件为基础，结合光学实验的相关技术，尤其是泵浦-探测原理及技术，搭建用于研究生物大分子荧光动力学的频率上转换时间分辨荧光光谱实验系统。如图1所示，这套系统大致可以分为三个主要组成部分，分别是光路系统、探测系统和程序控制系统。

图1

再生放大器（Spitfire Pro ,Spectra Physics）输出中心波长为800nm，平均功率为2W，重复频率为1kHZ的飞秒激光脉冲，其脉宽在40fs左右。采用分束镜将激光分为两路。其中一路经光学延迟线（High-Performance Mid-Range Travel Linear Stages ,NEWPORT）作为探测光，光学延迟线的移动范围为-125mm至125mm，最小步长值（移动精度）为3μm，在具体使用过程中，延迟线的移动步长值一般要高于3μm以保证电机的精度。光学延迟线移动1mm，探测光光程改变2mm，对应的△τ时间延迟为6.67ps，计算方法如下：

另一路经光学参量放大器(TOPAS ,Spectra Physics)，转换为特定波长的光作为激发光。激发光镜聚焦到1mm厚的环形样品池上使待测样品产生荧光，然后利用抛物面镜对样品荧光进行收集

为了避免脉冲展宽，采用凹面反射镜（焦距为300mm），将探测光聚焦在BBO晶体上，荧光经过抛物面镜（焦距约为180mm）聚焦到BBO晶体上。为了提高荧光的利用率，探测光的在BBO上的光斑面积通常略大于荧光聚焦在BBO上的面积。通过调整探测光的延迟，使探测光与荧光以一定的角度同步到达BBO晶体发生和频上转换相互作用，并以一对平凸透镜将和频光收集和聚焦到单色仪入射狭缝进行光谱探测。

在使用超短脉冲的实验中，往往还要关注脉冲的展宽问题。如果脉冲发生展宽，将会对实验造成很多不利的影响。对于激发光脉冲的宽度，有一点可以明确，只要激发光在时间上没有与荧光产生交叠，其轻微程度的展宽对于荧光频率上转换实验是几乎没有影响的，探测光则不然。为保障实验系统的时间分辨能力，应努力避免探测光发生展宽。在具体的光路设计中，探测光路一般不使用透射式的光学元件，如半波片、透镜、分束镜、基片等等，也就是说，探测光光路以反射式光学元件为主。例如，抛物面镜是一种良好的反射式平行聚焦光学镜片，光路采用抛物面镜聚焦和收集光束可以有效地避免脉冲光的展宽。检测探测光脉宽常使用的仪器是飞秒激光自相关仪（通常，通过调节的啁啾来获取窄脉宽激光）。值得一提的是，当探测光脉冲宽度最窄时，出射光通常也正好处于最佳输出状态。

频率上转换荧光光谱系统的噪声一般来源于激发光光路及和频光产生和收集光路。光学参量放大器涉及对泵浦光、闲频光、信频光等诸多成分的多级参量放大过程，其出射光的成分并不单一。尽管光学参量放大器自身配置的二向色镜等装置在很大程度上衰减了杂光，但是在空间共线情况下，光路中仍然会残存小比例的杂光成分。例如，当选用295nm作为激发光时，尽管釆用多重二向色镜（即对某波段的光透射增强，相应地对其他波段的光反射增强），光路中依然残存590nm等成分，如图2中插图所示。鉴于实验中的荧光及其上转换信号极其微弱，这些没有完全消除的杂光将会给和频信号的探测带来影响。对此，常常要在激发光路中进一步加入合适的滤光片，必要时采用棱镜对搭建光学滤波器来降低杂散光对频率上转换荧光探测系统灵敏度的影响。如图2所示，从TOPAS出射的光以布儒斯特角入射到专门定制的紫外融石英等腰棱镜上。等腰棱镜的顶角a为67.76°，对295nm光的折射率为1.48925，棱镜对之间的距离Lsep大致为光线在单个棱镜中所经过路程Lprism的10倍，即Lsep=Lprism×10。因为棱镜对不同偏振的入射光具有不同透射率和反射率（布儒斯特定律），所以入射光应为水平偏振的，若非如此，则需添加半波片HWP将其转到水平偏振方向。最后，利用光阑或者狭缝遮挡掉分离出来的多余的杂光。

图2

根据荧光发射原理和特点，在荧光入射到非线性晶体之前的光路中，通过添加适当的滤光片以抑制光路中的背景噪声，如图3中的F1和F2所示。以295nm激发色氨酸荧光为例，荧光光谱的斯托克斯位移，荧光发射光谱波长在300nm以上，因此在荧光光路中添加了300nm以上的高通滤光片F1(long pass 300nm)，其特点是对300nm以上的光具有较高的透过率，而对低于300nm的光产生较强的吸收，这样就避免了295nm的激发光对后续实验产生影响。另一方面，由于上转换信号的波长要比荧光和探测光更短，在和频光入射到单色仪之前的光路中加入300nm低通滤光片F2(short pass 300nm)，其对300nm以下的波长（和频光范围）具有较高透过率，而300nm以上的光波基本不能透过该滤光片。具体实验中，根据样品荧光发射光谱的特点来选择相应的滤光片组合。 

图3光路噪声的抑制

在和频光的产生和收集光路中，探测光与荧光以非共线的方式入射到BBO晶体上的，即荧光和探测光存在一定的交叉角度，如图3所示。这样设计是为了使上村换信号与探测光及未转换的荧光在空间上分离，便于利用光阑等将杂光挡住，从降低背景杂光对信号光的影响。相比两束光共线和频方式，非共线和频的效率确实是降低了，但考虑到提纯共线和频方式的信号光的复杂性和难性，非共线和频方式很大程度提高了频率上转换荧光实验的信噪比。

来自《频率上转换荧光光谱技术及其在生物大分子动力学中的应用》