荧光寿命成像是一种光学成像技术，其中每个像素的亮度代表荧光寿命，而不是光强度。荧光寿命是分子在发射光子之前保持其激发态的特征时间。该特征时间不仅取决于特定的荧光团，还取决于其环境。分子相互作用影响弛豫过程并改变荧光团的寿命。因此，FLIM可以区分分子相互作用的不同阶段。此外，荧光寿命不随分子浓度变化，因此非常适合研究分子层级上的生化作用，。

图 1

在各类FLIM方法中，时间相关单光子计数（TCSPC）可实现最高的时间分辨率和光子检测效率。上图显示了将FLIM与扫描共聚焦显微镜相结合的典型设置，空间滤波可改善轴向分辨率。设备主要构件包括：x-y-z压电扫描仪，可对样本进行亚微米级分辨率扫描；皮秒脉冲激光（Swabian Instruments DLnSec 520）；光子计数检测器（如Excelitas AQRH）。所有信号均由Swabian Instruments Time Tagger捕获。

在时间相关单光子计数实验（如TCSPC-FLIM）中，最高时间分辨率通常受激光脉冲的持续时间及探测器和TDC的电子抖动限制。超快激光器可解决大多数实验中的脉冲持续时间问题，因此探测器的电子抖动通常才是关键参数。例如，典型的单光子雪崩探测器（SPAD）抖动约为50到300 ps。另一方面，现代超导纳米线单光子探测器（SNSPD）的发展已经实现低于15皮秒的时间分辨率。为利用这种探测器获得最佳时间分辨率，TDC抖动最好比探测器抖动小两倍以上。

在分子环境参数的测量中，例如1）、pH成像，就是通过用pH敏感的荧光探针对样品染色来实现。这些探针通常具有质子化和去质子化形式，根据当地环境的pH值，这两种形式之间存在平衡。如果两种形式具有不同的荧光寿命，那么平均寿命就是pH的直接指标。

pH敏感染料的典型代表是2′,7′-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxy fluorescein (BCECF)。下图显示了皮肤组织pH成像的一个例子。左侧显示单个指数寿命图像，右侧显示不同区域的衰减曲线。

图 2用BCECF染色的皮肤组织的寿命图像。右侧分别为低pH（上半部分）和高pH（下半部分）区域的荧光衰减曲线。

还有2）、钙成像：Ca²⁺离子参与细胞内转运、膜电位、肌肉收缩、基因表达和细胞分化等多种细胞功能。Ca²⁺传感器机理是荧光团具有两种不同形式，其荧光量子效率和荧光寿命均不同，且Ca-bound 的寿命比 Ca-unbound的寿命要高。因此，净荧光寿命取决于Ca²⁺浓度。传统的Ca²⁺染料，如Calcium Green和Oregon Green Bapta, 在以荧光寿命为基础的Ca²⁺测量实验中，都可以观察到很明显的寿命变化。如下图3和图4所示。

图 3用Oregon green OGB-1 AM染色的培养神经元的FLIM图像。右侧分别为低Ca（上半部分）和高Ca（下半部分）区域的衰减曲线。

图 4用Oregon green OGB-1 AM染色的大麦根尖的FLIM图像。（荧光寿命表示Ca浓度）

可以通过特殊的TCSPC FLIM技术来测量极短时间内细胞中的Ca²⁺浓度变化，如下图5显示了在几毫秒内活神经元Ca²⁺浓度的变化。

图 5神经元中的Ca²⁺的变化，时间间隔为38毫秒。

3)、氯化物成像：氯离子浓度对神经系统的功能有重要影响，通常用MQAE（奎宁衍生物）作为荧光探针。用Cl-猝灭MQAE，用Stern-Volmer关系计算其寿命变化。下图6显示了用MQAE染色的小鼠脊神经节。荧光寿命短表示氯离子浓度高，反之表示氯离子浓度低。

图 6用MQAE染色的小鼠的脊髓神经节，寿命短表示Cl-浓度高。

4）、局部粘度测量：局部粘度对细胞内生化反应的速率有很大的影响，在亚细胞水平上粘度的变化已经被证明伴随着广泛的细胞功能障碍。已发表的文献表明血液病、糖尿病、Alz-heimer病、肝功能不全和癌症都有粘度变化。图7显示了基于Bodipy荧光探针的粘度测量。

图 7基于Bodipy探针的粘度测量。荧光寿命长表示高粘度。

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