新型二维InGaAs检测器热电冷却至-85°C促进科学研究

介绍

分子氧是保持生命的最重要的分子之一，以及生命被消灭的机制，材料被破坏。几十年来，研究人员一直对分子氧的最低激发态，单线态氧（¹O₂）的物理和化学性质感兴趣。特别地，单线态氧具有独特的反应性，可导致聚合物降解或生物细胞的死亡。其作为细胞死亡中间体的作用被光动力学治疗（PDT）用于癌症，一种将光用作医疗工具的技术^1,2。

在PDT中，将光敏剂（PS）掺入异常组织中，然后用可见光照射，使其通过II型光化学途径将能量转移到基态氧，产生单线态氧（可以通过其弱的1270nm直接检测排放）³。由于对阐明单线态氧在亚细胞水平上的生物化学作用的特殊兴趣，已经提出了几种高空间分辨率方法来使用单个光电倍增管（PMT），线性InGaAs检测器阵列或二维InGaAs检测器³。

在本应用笔记中，使用普林斯顿仪器公司的NIRvana：640 InGaAs相机的新型显微光谱设备由Charles University（捷克共和国布拉格）的Marek Scholz博士评估。 Scholz博士报告说，新的NIRvana®相机的二维InGaAs阵列使自己和由JanHála教授领导的光学分析组的成员能够解决¹O₂磷光的潜在光谱重叠与NIR扩展发光的问题PS，从而提供了首次区分和分离它们的有效手段⁴。

实验装置

实验装置利用两个检测通道（VIS和NIR），与光敏剂的可见荧光同时进行单线态氧和光敏剂非常弱的近红外磷光的实时成像。 这种创新的设置（参见图1）使得能够基于单个氧气和来自各个单元的光敏剂发光获得光谱图像。 图像的一个维度是空间的，另一个是光谱，覆盖从500到1700nm的光谱范围。

图1.近红外发光显微光谱设置：下图示出了通过VIS和NIR路径检测的光谱区域

 DOI：10.1039 / c4pp00121d - 由皇家化学学会（RSC）授权代表欧洲光生物学协会，欧洲光化学协会和RSC转载

如图1所示的直接实时成像设置是围绕奥林巴斯倒置荧光光学显微镜构建的，并且使用405nm恒定波长（CW）激光器作为激发源。激光束通过中性密度（ND）滤光片并通过500nm二向色长距离反射镜（DLP）耦合到NIR校正物镜（OBJ）中。通过在激励路径中插入透镜（L₁），将样品（S）上的照明光斑放大至约94μm。为了将由物体采集的发光发射引导到NIR路径进行检测，插入金镜（GM）。卸下镜子将发射导向VIS路径。

在NIR路径中，信号通过NIR长通和短通滤波器（F）的组合;过滤器组合取决于具体的实验。然后，信号由无色透镜（L₂，f = 20cm）聚焦到Princeton Instruments的Acton SpectraPro 2500i成像光谱仪的入口狭缝上。该光谱仪与来自普林斯顿仪器（见图2）的NIRvana：640 InGaAs相机相连。为了减少暗电荷，将相机的NIR敏感二维焦平面阵列（FPA）冷却至-80°C。

图2实验装置的NIR路径包括普林斯顿仪器NIRvana：640二维InGaAs检测器，耦合到SpectraPro 2500i成像光谱仪。 查尔斯大学Marek Scholz博士提供图片。

2500i光谱仪配置有用于光谱的光栅（150 g / mm，1.2μm闪耀）或成像镜。为了最小化样本光漂白，激光路径中的快门（SH）由NIRvana摄像机控制，仅在曝光时间打开。在成像模式下，样品上的0.34×0.34μm的面积被放大到

NIRvana的FPA的像素尺寸为20 x 20μm，对应于58x放大倍数。在1275nm（¹O₂磷光带），由衍射极限的空间分辨率约为1.4μm，根据瑞利标准，由目标数值孔径0.55确定。在光谱模式中，由光谱仪的入射狭缝的宽度确定的系统的光谱分辨率为10nm。

或者，在VIS路径中，将Princeton Instruments的Spec-10：400B背照式CCD照相机连接到Acton SpectraPro 2300i成像光谱仪。最近，为了同时检测VIS和NIR光谱区域，通过用短路分色镜（DM）代替金色镜子来修改设置。原来的一组过滤器也被修改。参考Scholz et al。 2014年有关实验设置的更多详细信息。

结果与结论

光谱成像方法的引入提供了一个强大的新工具，用于区分和分离¹O₂磷光的光谱重叠与光敏剂的NIR扩展发光。它可以应用于任何PS表现的近红外发光。一些数据如下所示;更多的可以在Scholz等人2014年。

在连续照射细胞的同时捕获图3A中显示的图像，以1W / cm 2的激光功率在基于D2O的盐水溶液中用100μMTMPyP孵育5小时。通过将连续10个连续帧的最后四帧（即总共20秒曝光）相加，每次曝光时间为5秒，获得> 1250nm图像（使用850和1250nm长通滤波器的组合）。随后，以25秒曝光获得光谱图像。之后拍摄明场和荧光图像。光谱表明，¹O₂磷光是主要的光谱特征。对于不同的电池，证实当使用1350nm长通滤波器代替1250nm长通滤波器时，> 1250nm图像强度下降超过70％。

图3基于近红外发光的图像和光谱伴随着3T3小鼠成纤维细胞的明场和VIS荧光图像，在100微米TMPyP中在基于D2O的盐水溶液中孵育5小时。

 框架A和B表示两个不同的样本。绿色矩形由光谱仪的入口狭缝定义，并表示从中收集光谱图像的区域。 通过光谱图像的垂直分档获得光谱图。 

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应用具有单位半径的高斯模糊滤波器来平滑光谱图像，以使弱光谱特征更加可区分。从使用相同方法培养的不同细胞捕获图3B中显示的图像。通过用2.5W / cm 2的激光功率照射这些细胞来拍摄四个近红外图像。首先，采用850nm长通和1100nm短路滤光器的组合，以1秒曝光获得850-1100nm图像（I₁）。接下来，以5秒曝光拍摄> 1250nm图像（I₂）。之后，将1次曝光的'850-1100nm + NaN3'图像（I₃）和5秒暴露的'> 1250nm + NaN3'图像（I₄）获得，将10mM NaN₃的等分试样加入到样品，轻轻搅拌，然后在黑暗中放置5分钟。观察到850-1100nm信号的轻微下降，这可能表明一定程度的光漂白。然而，在> 1250nm图像（I₄）中，在添加NaN ₃之后观察到更大的信号下降。假设在I₄图像中，主要由TMPyP的NIR背景发光形成的1O2信号几乎完全淬灭。这四个图像I₁-I₄的组合允许研究人员重建¹O₂发光的真实图像。已经证明使用NIR敏感的二维InGaAs焦平面阵列作为检测器的这种新的实验装置足以产生用TMPyP孵育的单个D 2 O处理的成纤维细胞的¹O₂图像和光谱图像。该设置的¹O ₂磷光检测的总体效率估计为1-3％。主要限制因素被确定为物镜的数值孔径（N.A. = 0.55）。

启用技术

根据Scholz博士的说法，NIRvana：640相机（见图4）比以前使用的1D InGaAs检测器的主要优点是NIRvana检测阵列的二维度，这导致了采集时间的显着降低，并避免了一些 样品光漂白引起的问题。

图4普林斯顿仪器NIRvana：640相机具有二维InGaAs检测阵列，可以在-85°C下进行电热冷却。

NIRvana：640由Princeton Instruments专门为科学研究应用而设计，需要极好的线性度和出色的近红外灵敏度。 它的640 x 512 InGaAs检测阵列，可将响应从0.9μm提高到1.7μm，可以低至-85°C进行热电冷却，以最大限度地减少热产生的噪声并提高信噪比。

为了量化新型微观光谱仪的性能参数，布拉格组进行了一项实验，以确定NIRvana的黑噪声：640（at-80℃）。 结果如图5所示。

图5每像素的黑暗计数和每帧不同曝光时间的标准偏差（NIRvana：640摄像头）。

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NIRvana：640 InGaAs摄像机还提供16位数字化和低读出噪声，出色的动态范围。此外，最新的Princeton InstrumentsLightField®64位数据采集软件可作为选件提供，可以通过非常直观的用户界面完全控制所有NIRvana硬件功能。 LightField提供自动缺陷校正，精确曝光控制和大量创新功能，便于捕获和导出成像和光谱数据。

概要

单分子氧是分子氧的第一激发态，是一种高度反应性的物质，在广泛的生物过程中起着重要作用，包括细胞信号传导，免疫应答，大分子降解和光动力学治疗期间的肿瘤组织消除4。通常，使用光敏化过程从基态氧产生单线态氧。

在布拉格查尔斯大学开发和使用的创新实验设备允许研究人员对单线态氧进行直接，实时成像，同时解决与光敏剂发出的光的潜在光谱重叠的问题。这种快速数据采集显微光谱设置依赖于普林斯顿仪器公司的NIRvana：640 InGaAs检测器的二维阵列和卓越的近红外灵敏度。

参考文献

1. Schweitzer C. and Schmidt R. Physical mechanisms of generation and deactivation of singlet oxygen. Chem. Rev. 103, 1685–1757 (2003).

2. Skovsen, E. Progress report: Non-linear two-photon singlet oxygen emission microscopy. Department of Chemistry, University of Aarhus, Denmark (2004).

3. Hu B., He Y., and Liu Z. NIR area array CCD-based singlet oxygen luminescence imaging for photodynamic therapy. Journal of Physics: Conference Series 277 (2011).

4. Scholz M., Dědic R., Valenta J., Breitenbach T., and Hála J. Real-time luminescence microspectroscopy monitoring of singlet oxygen in individual cells. Photochem. Photobiol. Sci. 13, 1203–1212 (2014). DOI: 10.1039/c4pp00121d

 文章来源Princeton Instruments