与传统的光学显微镜相比，光声显微镜（optical-resolution photoacoustic, PA microscopy, OR-PAM）可以提供更高的光学吸收对比度，同时具有无标记成像能力。在该方案中，提出了一种基于可见光（visible, VIS）激光二极管的OR-PAM系统，使用尺寸为1.8×1.2×1.2cm3的低成本脉冲激光二极管（SLD3237VFR，Sony，Japan）。功率为300mW，工作波长为405±5nm，脉冲能量低至52nJ。搭配使用3.6MHz超声换能器，横向分辨率为0.95μm，信噪比为38dB。在没有外源造影剂的情况下对小鼠背部的皮下微脉管系统成功地进行了离体成像。由于血液对可见光波段吸收更强，图像对比度得到了显著的改善。

激光二极管使用端面涂层材料来提高光输出阈值并保护COD。如图1（a）所示，其直径为3.8毫米，最高可在90°C时保持正常工作状态。图1（b）显示了用准直透镜组装的激光二极管，其体积为1.8×1.2×1.2cm3。光束直径约为4mm，发散角为2.0mrad。如图1（c）所示，测得脉宽为174ns，脉冲重复频率为1kHz。

图 1

显微镜光学照明使用数值孔径（NA）为0.60的非球面物镜（C671TME-405，Thorlabs，USA），其工作距离为2.12mm，有效焦距为4.01mm。激光二极管的驱动电路也是7×4cm2的小尺寸，固定在用于光栅扫描的微型三维（3D）电动载物台上。

图2为系统示意图。传感器使用超声波换能器(V382-SU, Olympus, Japan)，中心频率为3.6MHz。将填充有超声凝胶的塑料管固定在换能器的上端，用一块微盖玻片将模体放置在其上。超声凝胶将来自模体的声音耦合到换能器。在正向模式下能够检测到激发的光声波（photoacoustic wave），通过换能器将其转换为电压信号，并通过低噪声前置放大器进一步放大。然后使用脉冲接收器和截止频率约为7.0MHz的低通滤波器，优化信噪比。发送脉冲时钟进行数据采集，该触发信号与来自激光二极管驱动器的时钟输出信号同步。沿着水平x-y平面平移实现3D扫描。（假设超声速度为1.5μm/ns）

图 2

由于VIS激光二极管功率较低，应特别注意VIS OR-PAM系统噪声。通常除了随机热噪声之外，还有来自激光二极管和电动级驱动器的干扰信号。图3（a）给出了沿z轴捕获的人体头发的瞬态时间分辨信号。有效光声信号和声反射隐藏在背景噪声中。并且可以看出，对原始数据（蓝色曲线）做16次信号累加并平均后（红色曲线），信噪比得到了明显的改善。为了比较，图3（b）给出了7.0MHz低通滤波后的信号。可以看出，高频随机噪声已经被有效滤波，并且信号平均的效果进一步使噪声最小化。有效光声信号的峰值电压约为50mV，上限信噪比约为22dB。同时，触发信号的峰值电压超过160mV，持续时间约为2.0μs。

图 3（a）人发的原始信号及16次累加平均信号（b）通过低通滤波器后的原始信号及16次累加平均信号

为了测量OR-PAM系统的横向分辨率，对碳纤维（AGM-94，Asbury Carbons，USA）的边缘在水中成像，如图4（a）所示。显微镜使用40×物镜。可以清晰地看到碳纤维的边缘图像，其信噪比高达38dB。图4（b）给出了在y=10μm处的横截面轮廓，沿y轴平均碳纤维的边缘来估计边缘扩散函数（the edge-spread function, ESF）。线扩散函数（the line-spread function, LSF）是从ESF的导数中提取出来的，使用高斯函数[A*exp（-（（x-B）/C）²）]拟合，其中A=23.88，B=12.48和C=0.5633。最终根据全宽半最大值（FWHM），横向分辨率约为0.95μm。

图 4（a）7μm碳纤维边缘的图像。（b）由ESF及其导数所定义的系统横向分辨率。

为了证明该系统的成像能力，我们成像了一个毛细管大小的研磨碳纤维网络。将碳纤维悬浮在粘性超声凝胶中，以1μm的步长扫描80×50μm2的成像视场（FOV）。图5（a）给出了表面层中碳纤维网络的横截面图像，该表面层与换能器的距离（沿z轴）约为5.07mm。由光声波的传播时间可以得到沿z轴的深度信息，图中碳纤维的相对位置和表面缺陷清晰可见。图5（b）给出了通过以5-μm步长沿z轴扫描激光点而获得的MAP图像，图（a）中缺失的碳纤维出现在该图像内。

图 5

为了证明OR-PAM系统的无标记成像可行性，我们对小鼠背部的皮下微血管系统进行离体成像。在实验之前，如图6（a）所示，用脱毛洗剂从皮肤上轻轻地除去毛发，并在小鼠皮肤上施加薄层超声凝胶。然后以5μm的步长和平均512个脉冲的信号扫描990×330μm2的成像视场。在图6（b）中，微脉管系统的PAM图像与用相机拍摄的照片一致。然而，只有在PAM图像中观察到小血管，图中用箭头标出的直径为15μm的毛细管。目前的透射模式OR-PAM只能成像薄样品，不适合体内应用。相比之下，反射模式OR-PAM不受样品厚度的限制。先前已经报道了反射模型PAM的许多方法，包括环形换能器，光声组合器和暗场物镜。通过类似的修改，我们的VIS OR-PAM系统可以适应反射模式，可以应用于体内更多的解剖部位。

图 6

来自Lvming Zeng <Label-free optical-resolution photoacoustic microscopy of superficial microvasculature using a compact visible laser diode excitation>