由于光学衍射极限的存在，常规显微镜在小尺度成像时分辨率受到限制。而荧光显微镜允许以最小的侵入方式对细胞进行高对比度成像。本文档简要概述了Stefan W. Hell于1994年介绍的STED技术。NKT Photonics的SuperK和Onefive KATANA HP激光器可以实现灵活的脉冲激励以及可见光和近红外范围内的同步耗尽。

在生物、医学和材料科学领域中，STED显微术被广泛用于研究远低于光学衍射极限的高空间分辨率的发光样品。即利用受激辐射的基本原理，首先使用环形光激发荧光样品，然后使用一束环形光将激发光光斑周围的荧光损耗掉，使得发荧光的点 减小，进一步压缩成像的点扩散函数，从而提高分辨率。

图 1

其中左边为激发脉冲，中间为环形激光脉冲，右边为耗尽后的超分辨荧光信号。

图 2

如图2所示，在光路上STED的实现总体来说并不复杂，只需要在准直的圆偏振光之后插入一片相位板产生环形光并将这个环形光与原来的激发光嵌套在一起即可。

具体搭建的光路如图3所示：超连续激光由经由光阑至PBS将光束分为功率相同的两束线偏振光。光阑起到简单法拉第隔离器的作用。两束激光中的一束经过激发光滤片获得激发光，一束经过损耗光滤片获得损耗光。光谱数据使用光纤光谱仪获得，损耗光的损耗光经过针孔空间滤波系统，传递到螺旋相位板获得相位延迟。激发光经过针孔空间滤波系统，光学延迟系统，在二向色镜的位置与损耗光合为一束之后，经过四分之一波片变为圆偏振光，通过4f系统传递至显微镜扫描头的振镜端。显微镜光束的高精度校准使用直径为80nm的金纳米颗粒，并需要将共聚焦调整至反射光模式下。

图 3

其中D:光阑，M:反射镜，PBS:偏振光分束器，F:带通滤波器，S:光学快门，L:透镜，PH:针孔，OD:光学延迟，VND:连续可调中性密度衰减片，VPP:螺旋相位板，DM:二向色镜，λ/4:四分之一波片，LeicaSP5: SP5 显微镜。

图 4荧光信号随时间的变化。

图4上部分从环形光束的中心最小值开始，下部分为环形光束的耗尽区域。

SuperK超连续谱激光器可在可见（Vis）和近红外（NIR）范围内提供连续光谱，具有出色的单模光束轮廓（M2 <1.1）和皮秒（Ps）脉冲持续时间。结合我们的过滤技术，它可以转化为可调谐激光源，从而可以优化Vis和NIR区域中每种发色团的吸收激发。

图 5 Super K激光器多线滤波器传输超连续光。

One-Vis KATANA HP激光器可在Vis-NIR内的各种波长下使用，并在Ps脉冲持续时间内提供高脉冲能量，使其成为STED耗尽的理想选择。

图 6

图6中蓝色曲线表示SuperK Extreme EXW-12的光谱功率密度，红色曲线KATANA HP激光器的可用波长。

除了使用适当的波长和激光功率级别的组合外，在STED显微镜中，精确调节激发和耗尽激光脉冲同步至关重要，以便在每个荧光周期开始时同步激发发色团的有效消耗。

图 8 激励和耗尽脉冲的时间

在实验中，分辨率主要受所用发色团的光物理学限制。

来自https://www.nktphotonics.com/lasers-fibers/application/sted-microscopy/

中科院《受激辐射损耗显微术的研究和应用》